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瞬时表达最新视觉报道_瞬间的雅称(2024年12月全程跟踪)

内容来源：夯出奇迹所属栏目：热点更新日期：2024-12-03

瞬时表达

萤火素酶互补实验技术全攻略 𐟔 实验细节解析 𐟓– 表达载体的选择构建成功的重组质粒是实验成功的关键。目标基因与报告基因必须在同一个阅读框，这是首要条件。其次，选择正确的融合位置也很重要。例如，NLuc通常位于目标蛋白的C末端，而CLuc可以位于N末端或C末端。为了更精确地检测NLuc和CLuc，表达载体中加入了3XHA标签，方便用HA抗体检测。 𐟔砨ᨨ𞾨𝽤𝓧š„构建随着克隆技术的进步，推荐使用In-Fusion反应进行载体构建，具体方法可参考试剂盒说明书。 𐟓Š 正负对照的设置每次实验都应设置正负对照以确保实验体系的可靠性。正对照可以选择已经发表的互作蛋白质对。负对照则应选用与待检测蛋白具有相似亚细胞定位但不互作的蛋白质，或者选择没有活性的突变蛋白。 𐟔 蛋白检测的重要性只有当融合蛋白正确表达时，才能判断目标蛋白之间是否存在相互作用。如果待测蛋白没有互作，即使正负对照都正常表达，也需要用WB检测待测目标蛋白质对在瞬时表达体系中的表达及表达丰度。 𐟔젥䧨焦表›‹白质互作的筛选和验证 LCA技术可以定性检测和定量检测蛋白质的互作，为大规模筛选和验证提供有力工具。

BiFC实验常见问题解答𐟌🯼ˆ第三期） 𐟌𑠤𘺤𛀤𙈦œ‰些基因在酵母双杂中显示互作，但在BIFC中无信号？由于酵母双杂实验中，BD融合诱饵蛋白可能单独激活，而AD融合靶蛋白如果有DNA特异性结合，也可能单独激活报告基因表达，导致假阳性结果。此外，某些重组可能破坏蛋白互作，且不同外源基因的瞬时表达效率差异大。建议在BIFC之前先进行亚细胞定位，评估两个基因的表达效率，以便调整转化条件。 𐟌🠥“ꤺ›基因适合在原生质体中定位，哪些适合在烟草植株中定位？选择受体时，通常根据研究物种来决定。原生质体是没有细胞壁的不完整植物细胞，对外界逆境反应敏感，某些基因表达后可能对原生质体有毒，导致无法观察到荧光。烟草体系中，注射法浸染烟草细胞，完整的植物细胞对逆境的抗性更强，表达后容易观察到荧光。如果基因表达时间较长，更适合在烟草中操作。烟草细胞中细胞壁、细胞质和细胞膜等结构挤在一起，不便于区分，因此定位到具体细胞器的基因更适合在原生质体中表达，观察更明显。 𐟌ž 在烟草BIFC中，什么样的光才算有效光？制片过程中，应尽可能清理干净叶片表面的杂质，排除气泡。观察显微镜时，激发光电压不能打得太高，烟草细胞的轮廓应清晰可见，且分布均匀。 𐟌𑠤𘺤𛀤𙈦œ‰些基因在原生质体中定位显示无信号或信号弱？不同基因之间的表达差异很大，表达时间也各有不同。针对无信号的结果，建议至少重复两到三次实验，如果还是没有结果，建议使用烟草叶片侵染，因为有些基因对原生质体有毒，且在原生质体中表达时间比烟草短。其次，原生生物和真核生物对相同基因的表达存在一定差异。针对信号弱的结果，建议在载体构建上增强启动子，并至少重复两到三次转化。以上是BiFC实验答疑的全部内容，大家关于实验还有其他问题欢迎在评论区交流探讨～

电转感受态电转仪器在生物医学领域展现出强大的潜力，特别是用于类器官转染和瞬时转染CHO细胞。这些技术突破了传统转染方法的限制，大大提高了转染效率和蛋白产量。 𐟌𑠧𑻥™襮˜转染：突破技术瓶颈类器官技术是近年来生物医学领域的重大突破，通过体外三维培养组织干细胞形成微型器官。人神经类器官在组织结构、细胞类型和功能方面与来源组织高度一致，成为理想的研究模型和药物研发平台。然而，传统转染方法存在转染效率不稳定和细胞状态变化等问题。 MaxCyte电转系统能够高效地将质粒转染到类器官中，并穿透类器官结构内的所有细胞层到达最深层。优化后的电转方法使得人神经类器官的最深层均能观察到绿色荧光，证明了MaxCyte电转系统在类器官转染中的强大能力。 𐟒‰ 瞬时转染：快速抗体蛋白生产在抗体药物的临床前研发阶段，需要快速小规模表达多种抗体。稳定细胞株虽然表达量高，但筛选耗时太长，不适合早期研发。MaxCyte瞬时表达技术可以在短时间内获得足够的蛋白样本，用于研究。结果显示，MaxCyte ExPERT瞬时转染CHO细胞在两周内能够获得克级抗体的产量，满足临床前实验所需蛋白量。而且系统放大的一致性很高，极大缩短了抗体研发到生产的时间。通过瞬时转染生产克级规模抗体，抗体候选分子在CHO工业化生产中展现出巨大潜力。这些技术不仅提高了抗体药物的研发效率，还为生物医学研究和药物研发提供了强有力的支持。

基因调控全攻略𐟓š 在研究基因功能或验证药物靶点时，基因过表达、敲低和敲除是必不可少的步骤。很多科研人员可能对这些方法感到困惑，因此整理了一些体外细胞实验中常用的过表达、敲低和敲除方法，供大家参考。体内动物的基因编辑将在下一期讲解。基因过表达 𐟓ˆ 基因过表达是将目的基因的编码区序列（CDS）克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用载体骨架上的调控元件，使基因在人为控制下大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。质粒：瞬时转染普通编码基因过表达 miRNA过表达 lncRNA过表达 circRNA过表达特点：过程简单：常规质粒载体通过常规转染即可将质粒转入细胞。载体容量大：有足够大的容量放置感兴趣的序列。表达水平高：表达水平较高。表达时间短：表达时间较短。慢病毒：稳定转染慢病毒重组载体构建完成后需要辅助质粒的参与才能包装形成病毒颗粒。通过对上清液中活体病毒的直接收集或进一步浓缩病毒后可用于转染靶细胞，释放到宿主细胞中的病毒RNA逆转录成双链DNA，进一步整合到宿主细胞的基因组中。感染谱广：感染范围广泛。稳定表达：通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长期稳定表达。安全性高：安全性较高。包装容量有限：插入的外源基因需在4kb以下。包装滴度较低：包装滴度较低。基因敲低 𐟓‰ 基因敲低是利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。 siRNA：瞬时转染小干扰RNA（siRNA），是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。基因敲除 ✖️ 基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9技术是一种常用的基因编辑技术，通过在基因组中引入特定的DNA片段，实现基因的敲除。希望这些信息能帮助大家更好地理解和掌握基因过表达、敲低和敲除的方法，欢迎交流学习！

𐟐��˜定点敲除小鼠产仔少的真相𐟔 𐟤”你是否也遇到过定点敲除小鼠产仔量少、甚至不育的问题？我深入探索了这个问题，并终于找到了答案！ 𐟐𞥜覈‘的研究中，我发现CDH16-CRE小鼠的产仔量特别少，每胎仅生2-3只，且雌鼠存在生育问题。经过长时间的探索，我意识到这可能与CDH16基因在生殖器官中的表达有关。 𐟔通过进一步的搜索和了解，我发现CDH16基因在胚胎发育的某一时期会瞬时表达于生殖管组织。这让我意识到，定点敲除这个基因可能影响了小鼠的生育能力。 𐟒᤺Ž是，我改变了配繁策略，雌鼠均用flox纯和，而CRE阴性的小鼠雄性用flox纯和，CRE杂合的小鼠。结果令人惊喜，每只雌鼠一胎可生6-10只，且正常喂奶！ 𐟎‰因此，如果你也遇到了类似的问题，不妨从了解你的目的基因是否会影响生殖开始，并考虑在构建定点基因敲除小鼠时调整策略。 𐟒ꥸŒ望我的经验能给你带来启发和帮助！一起加油吧！

烟草叶片Co-IP实验，一文搞定！嘿，大家好！今天我要和大家分享一下如何在烟草叶片中进行瞬时表达和免疫共沉淀（Co-IP）实验的详细步骤。这个实验流程真的是相当复杂，但只要按照步骤来，其实也没那么难。准备好了吗？Let's go！材料和试剂 𐟛’ 首先，你需要准备一些材料和试剂。以下是你需要的东西：烟草种子：选那种生长在22℃下四周龄左右的烟草。农杆菌菌株：已经转入双元载体的农杆菌，比如pCAMBIA1300、pBIN19等，靶基因带有蛋白标签，这里以3㗆LAG标签为例。乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）：诱导剂。 MES（pH5.6）（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）：调节pH值。蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：04693132001）：防止蛋白降解。 NP-40（Fluka，目录号：74385）：用于提取蛋白。诱导培养基：具体配方见图二。侵染培养液：具体配方见图三。提取缓冲液：和诱导培养基、侵染培养液一样。 TBS：和提取缓冲液一样。 4㗓DS：和提取缓冲液一样。设备 𐟔犦Ž夸‹来是需要的设备： Anti-FLAG珠（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）：用于免疫沉淀。 3㗆LAG多肽（Sigma-Aldrich，目录号：F3290）：用于检测FLAG标签的蛋白。蛋白G琼脂糖珠（GE，目录号：17-0618-01）：用于免疫沉淀。农杆菌培养用的试管、摇床等。离心机。 1mL注射器。实验步骤 𐟓 好了，材料和设备都准备好了，接下来就是实验步骤啦！准备工作：首先，选生长在22℃（16h光照/8h黑暗）四周龄左右的烟草。将带有3㗆LAG标签的农杆菌菌株在3mL含有相应抗生素的LB液体培养基中28℃、200rpm过夜培养。诱导培养基准备：将LB培养基中的农杆菌接种到诱导培养基中（过夜培养物按1/100稀释，或者培养8h的培养物按1/25稀释）。可以在早上准备好后当晚进行侵染，或者在晚上准备好后第二天早上做侵染。农杆菌培养：28℃、200rpm培养8-12小时，使农杆菌细胞处于对数生长期，OD=0.6-0.8。离心：将农杆菌培养物在50mL离心管中以3200㗧的速度离心10分钟。侵染培养液准备：准备好侵染培养液，在5-10mL的侵染培养液中重悬农杆菌沉淀。重悬农杆菌：使农杆菌重悬液的OD=0.1-0.3，每片叶子准备1mL重悬液即可。如果你想表达两种及以上蛋白，将每种农杆菌调好OD后混合即可。对于不同的质粒，推荐先进行预实验，通过调节OD值来控制蛋白的表达量，例如用更高OD的农杆菌来表达低丰度蛋白，用更低OD的农杆菌来表达高丰度的蛋白。小结 𐟓 好了，这就是整个实验的详细流程啦！希望对大家有所帮助。免疫共沉淀实验虽然复杂，但只要按照步骤来，其实也没那么难。祝大家实验顺利！如果有任何问题，欢迎留言讨论哦！

Ｍａｒｃ－１４５细胞ＰＫＲ是如何进行基因遗传的？ ? 前言 ? 蛋白激酶Ｒ，又称为干扰素诱导的双链ＲＮＡ激活的蛋白激酶ＲＮＡ、真核翻译起始因子２🀩…𖯼’，由ＥＩＦ２ＡＫ２基因编码，是一种丝氨酸－苏氨酸激酶，能够被细胞、病毒的双链ＲＮＡ或合成类似物（如ｐｏｌｙ　Ｉ：Ｃ）激活，在宿主抗病毒防御过程中发挥重要作用。 ? 蛋白激酶Ｒ基因编码氨基酸序列分析 ? 将获得的Ｍａｒｃ－１４５细胞ＰＫＲ基因推导编码的氨基酸序列与已公布的上述各物种进行比对分析，可见序列同源性在５５．４％～９９．５％之间，与豚鼠及其供体物种非洲绿猴同源性分别最低、最高，与人同源性为８３．５％。 ? 同时，ＰＫＲ△６除豚鼠、家兔各１个氨基酸位点差异，其他６种均为ＬＦＩＱＭＥ基序，ＰＫＲ　２９６Ｋ高度保守， △６删除或者２９６Ｋ突变为Ｒ均能导致ＰＫＲ失活；４４６Ｔ与４５１Ｔ磷酸化是ＰＫＲ激活发挥作用的重要标记，但灵长类动物与其他几种哺乳动物在二者附近基序均存在遗传差异。 ? 将ＰＣＲ鉴定正确的阳性克隆提取重组质粒，测序结果证明获得了ＥＧＦＰ－ＰＫＲ融合表达的重组质粒ｐＣ１／Ｎ１－ＰＫＲ，转染后２４ｈ荧光显微镜观察ＥＧ－ＦＰ表达与否，验证ＰＫＲ能否融合表达，。 ? 结果表明ｐＣ１－ＰＫＲ转染后观察到绿色荧光蛋白，说明ＰＫＲ成功获得融合表达，而ｐＮ１－ＰＫＲ转染后未能观察到荧光蛋白表达。 ? 蛋白激酶Ｒ重组融合ＥＧＦＰ瞬时表达的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测 ? 瞬时表达后收获样品，以ＧＦＰ　Ｔａｇ　ｍＡｂ（ＧＦ２８Ｒ）为一抗，ＨＲＰ标记羊抗鼠ＩｇＧ为二抗进行Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测。 ? 检测结果与荧光显微镜观察结果一致，最终表明ｐＣ１－ＰＫＲ成功获得表达，而ｐＮ１－ＰＫＲ未能获得表达，因此选择ｐＣ１－ＰＫＲ开展后续相关研究。 ? ＰＫＲ被认为是ＩＦＮ诱导的抗病毒作用主要的效应因子之一，可以抑制多种病毒在细胞内的复制，它在调节细胞增殖和分化、诱导细胞凋亡和信号转导等方面也发挥重要作用。 ? 当病毒侵入感染细胞，在复制或转录过程中产生ｄｓＲＮＡ，单体ＰＫＲ与之结合后便形成二聚体，自我激活并催化自身磷酸化，磷酸化后的ＰＫＲ催化其底物ｅＩＦ２š„磷酸化，最终导致病毒蛋白合成受到抑制，从而产生抗病毒活性。 ? 但有些病毒为了逃逸宿主细胞的抗病毒效应，采取多种策略避免ＰＫＲ的抗病毒活性，而这些策略的发挥一般依赖于病毒基因组非编码区转录产物或者编码的蛋白。非编码区转录产物一般与ＰＫＲ直接结合，阻碍ＰＫＲ自身磷酸化。 ? 病毒编码蛋白发挥作用机制具有多样性，或是直接结合ＰＫＲ，以阻断与ｄｓＲＮＡ的结合，或是作为ＰＫＲ的伪底物，竞争阻止ｅＩＦ２㷩…𘥌–，或是作为ＰＫＲ的拮抗剂阻断ｅＩＦ２š„磷酸化，或是使ＰＫＲ下游效应分子ｅＩＦ２„𑧣𗩅𘥌–，或是同时抑制ＰＫＲ与ｅＩＦ２的磷酸化，甚至是降解ＰＫＲ等。前期开展ＰＲＲＳＶ体外感染ＰＡＭｓ研究表明，ＰＲＲＳＶ可以强烈抑制ＰＫＲ磷酸化，其底物ｅＩＦ２š„磷酸化水平相应受到抑制，说明ＰＲＲＳＶ可能通过这种途径达到促进自身增殖的目的。ＰＡＭｓ是ＰＲＲＳＶ感染的天然宿主细胞，但Ｍａｒｃ－１４５细胞是病毒体外增殖依赖的重要传代细胞系，由于细胞动物来源、原代细胞和传代细胞差异等，ＰＲＲＳＶ在Ｍａｒｃ－１４５细胞复制增殖时ＰＫＲ所起的作用尚不得而知，对其开展相关研究非常必要。 ? 结论 ? 综上所述，本研究成功克隆了Ｍａｒｃ－１４５细胞ＰＫＲ基因，对其遗传进化及同源性进行了分析与比较，并进行了融合表达，为进一步开展其与ＰＲＲＳＶ互作机制研究奠定了基础。

细胞转染的三种方法，你了解几种？在分子生物学实验中，细胞转染是一个关键步骤。除了之前提到的电穿孔法，还有三种常用的方法：化学介导和生物介导。让我们一起来看看这些方法吧！化学介导法 𐟧ꊧ㷩…𘩒™共沉淀法这种方法是通过形成DNA-磷酸钙复合物沉淀，这些沉淀会黏附在细胞膜表面，然后通过细胞的内吞作用将DNA导入细胞。沉淀颗粒的大小和质量对转染的成功至关重要，同时受pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间和细胞孵育时间等因素影响。这个方法操作简便，花费较低，但转染效率较低，通常只有10-20%，且重复性差。阳离子聚合物法这种方法利用带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，通过内吞作用进入细胞。相比阳离子脂质体，这种方法具有更高的转染效率，操作简单，适用范围广，重复性好。此外，它在体内的转染效率也较高，细胞毒性较低。脂质体转染这种方法是通过带正电的脂质体与带负电的核酸磷酸基团形成复合物，再与细胞膜上的唾液酸残基结合，可能经过内吞作用被导入细胞。这种方法使用简单，可以携带大片段DNA，适用于各种类型的裸露DNA或RNA，转染效率、稳定性和可重复性都大大提高。不过，转染时需要去除血清，血清的缺失会导致细胞毒性增加，且转染效果随细胞类型变化大。生物介导法 𐟦 逆转录病毒法这种方法通过病毒侵染宿主细胞的机制将外源基因整合到宿主细胞的染色体中，导致基因失活或激活癌基因，构建稳转株。它可以用于难转染的细胞、原代细胞和体内细胞等，但携带的基因不能太大（<8kb），且需要考虑安全因素。腺病毒法腺病毒除了卵细胞外，几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它宿主基因。它可以通过瞬时表达，包装8kb左右的外源基因，转染较容易，但转染效率不高。无论你是进行实验还是写作文章，这些方法都能为你提供很好的参考。如果你有任何疑问或需求，欢迎随时联系我们哦！

电转染细胞转染实验是分子生物学和细胞生物学中一项关键技术，用于将外源DNA（如质粒、基因片段、RNA等）导入真核或原核细胞，以研究基因功能、表达调控或进行基因治疗。根据转染方法的不同，细胞转染可分为化学法、物理法和生物法。 𐟑化学法转染：脂质体转染利用带正电的脂质体与带负电的DNA分子结合，形成DNA-脂质体复合物，通过静电作用吸附到细胞膜上，随后通过膜融合将DNA释放到细胞内。准备细胞：将细胞培养至适宜密度（通常为70%-80%汇合度）。准备DNA-脂质体复合物：根据说明书将DNA与脂质体在无菌无酶的离心管中混合，室温孵育一段时间以形成复合物。转染：将复合物添加到细胞培养基中，轻轻混匀。孵育：根据细胞类型和脂质体说明书的要求，在适宜条件下孵育细胞。更换培养基（可选）：根据实验需求，在转染后一定时间更换新鲜培养基。分析：根据实验目的进行后续分析，如基因表达检测、细胞功能测定等。 𐟔物理法转染：电穿孔法利用高压电场在细胞膜上产生瞬间孔洞，使DNA直接穿过细胞膜进入细胞。准备细胞悬液：将细胞从培养皿中收集并悬浮在适当的缓冲液中。加入DNA：将DNA与细胞悬液混合。电穿孔：将细胞-DNA混合物置于电穿孔杯中，施加高压脉冲。孵育与恢复：将处理后的细胞转移到培养皿中，在适宜条件下孵育，让细胞恢复并表达转入的基因。 𐟦 生物法转染：病毒介导的转染利用病毒载体（如逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等）将外源基因整合到宿主细胞基因组中或进行瞬时表达。准备病毒载体：根据实验需求选择合适的病毒载体，并扩增病毒。感染细胞：将病毒载体添加到细胞培养基中，使细胞感染。孵育：在适宜条件下孵育细胞，使病毒完成其生命周期并表达外源基因。筛选（可选）：对于需要稳定表达的细胞系，可能需要进行筛选以富集成功转导的细胞。分析：根据实验目的进行后续分析。细胞转染实验的成功率受多种因素影响，包括细胞类型、转染方法、DNA质量、实验条件等。在进行细胞转染实验时，需要根据具体情况优化实验条件以获得最佳结果。

细胞转染实验：从基础到实践细胞转染实验是分子生物学研究中的一项关键技术，它允许我们将外源性的DNA、RNA或蛋白质引入真核或原核细胞，从而深入探讨基因功能、表达调控以及疾病机制。根据转染的方式和所使用的材料，细胞转染可以分为多种方法，包括物理方法（如电穿孔法、显微注射法）、化学方法（如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法）和生物方法（如病毒介导的转染）。脂质体转染法 𐟌𑊊脂质体转染法利用带正电的脂质体与带负电的核酸分子（DNA/RNA）通过静电作用形成复合物，然后通过脂质体的膜融合或细胞的内吞作用将核酸分子导入细胞。准备细胞：选择合适的细胞系，调整至对数生长期，铺板至适当的细胞密度。准备转染复合物：按照脂质体转染试剂说明书，将DNA/RNA与脂质体按一定比例混合，孵育形成转染复合物。转染：将转染复合物加入到含有细胞的培养基中，轻轻混匀。培养：将细胞置于适宜条件下培养，根据实验需求进行换液或处理。检测：通过荧光观察、Western Blot、qPCR等方法检测转染效率和基因表达情况。电穿孔法 ⚡ 电穿孔法利用短暂的高电压脉冲处理细胞，使细胞膜形成暂时性孔洞，从而使外源DNA/RNA进入细胞。准备细胞：将细胞悬浮在电穿孔缓冲液中，调整至合适的细胞密度。电穿孔：将细胞与DNA/RNA混合后，置于电穿孔杯中，施加一定强度的电脉冲。恢复培养：将处理后的细胞迅速转移至含有培养基的容器中，置于适宜条件下培养。病毒介导的转染 𐟦 病毒介导的转染利用经过基因改造的病毒（如逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等）作为载体，将外源基因整合到宿主细胞基因组中或实现瞬时表达。病毒包装：在包装细胞内生产携带外源基因的病毒颗粒。病毒感染：将病毒颗粒加入到目标细胞中，使病毒感染细胞。培养：将感染后的细胞置于适宜条件下培养，使外源基因表达。注意事项 ⚠️ 选择合适的转染方法和条件，确保转染效率和细胞活性。注意实验安全，尤其是使用病毒介导的转染时。转染后应密切监测细胞状态，及时调整培养条件。根据实验需求选择合适的检测方法和时间点。通过这些步骤，我们可以更深入地了解细胞的内部机制，为生物学研究和药物开发提供有力支持。

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